一、引言

隨著分子生物學(xué)和臨床診斷需求的增長，實(shí)時(shí)熒光定量 PCR（qPCR）技術(shù)已廣泛應(yīng)用于基因表達(dá)分析、病原體檢測、SNP 分型、轉(zhuǎn)基因作物檢測、拷貝數(shù)變異研究等領(lǐng)域。羅氏（Roche）LightCycler 96 系列 qPCR 儀器自面市以來，以其精確的溫控系統(tǒng)、靈活的通量配置及友好的軟件界面，獲得了眾多實(shí)驗(yàn)室的使用認(rèn)可。本文將圍繞 LightCycler 96 的設(shè)計(jì)架構(gòu)、性能參數(shù)、光學(xué)檢測系統(tǒng)、軟件功能、典型應(yīng)用場景、日常操作與維護(hù)、二手設(shè)備驗(yàn)收要點(diǎn)以及售后服務(wù)支持等方面進(jìn)行全面介紹，為科研機(jī)構(gòu)、第三方檢測機(jī)構(gòu)和臨床實(shí)驗(yàn)室提供參考。

二、設(shè)備架構(gòu)與系統(tǒng)組成

LightCycler 96 儀器由機(jī)箱主機(jī)、溫控模塊、光學(xué)探測單元、觸控屏控制面板和外部配件（如電源線、通信線）組成。機(jī)箱尺寸（約 45 cm × 40 cm × 33 cm）適合常規(guī)實(shí)驗(yàn)臺(tái)放置；凈重約 17 kg，可滿足多點(diǎn)移動(dòng)與固定安裝需求。

• 主機(jī)外殼：防塵金屬材料，內(nèi)部設(shè)有風(fēng)道冷卻系統(tǒng)，維持元器件工作溫度。

• 溫控模塊：采用半導(dǎo)體 Peltier 器件加熱與制冷，溫度反饋采樣點(diǎn)分布于底板與蓋板，實(shí)現(xiàn)多點(diǎn)溫度監(jiān)控。

• 光學(xué)探測單元：集成 LED 激發(fā)源與光電倍增管（PMT）探測器，通過濾光片組選擇不同熒光通道。

• 控制面板：7 英寸觸摸屏，嵌入式操作系統(tǒng)即時(shí)顯示反應(yīng)進(jìn)程和曲線圖。

三、溫度控制系統(tǒng)

1. 溫控精度與均一性

• 溫度控制精度：± 0.1 ℃；

• 平板孔間溫差：≤ 0.3 ℃；

• 多點(diǎn)溫度傳感設(shè)計(jì)，實(shí)現(xiàn)對(duì)樣本架底板與蓋板同時(shí)監(jiān)控。

2. 升降溫速率

• 標(biāo)稱最大升溫速率：4.5 ℃/s；

• 標(biāo)稱最大降溫速率：3.5 ℃/s；

• 支持用戶自定義斜率曲線，滿足特定擴(kuò)增協(xié)議要求。

3. 保溫與預(yù)冷功能

• 儀器待機(jī)時(shí)可設(shè)定低溫預(yù)冷（4 ℃）模式，適合冷鏈需求實(shí)驗(yàn)；

• 自診斷功能每次開機(jī)執(zhí)行溫度校準(zhǔn)并自動(dòng)記錄校準(zhǔn)報(bào)告。

四、光學(xué)檢測系統(tǒng)

1. 多通道激發(fā)與檢測

• 激發(fā)光源：四色 LED（Blue, Green, Yellow, Red），覆蓋 450–660 nm 是別；

• 檢測通道：最多可設(shè)定 5 個(gè)熒光通道，兼容 FAM、HEX/VIC、ROX、Cy5、Cy3 等常用染料；

• 動(dòng)態(tài)濾光片切換時(shí)間：＜ 10 ms，保證快速的多重檢測執(zhí)行。

2. 探測器性能

• 光電倍增管（PMT）檢測，信噪比可達(dá) 1:800；

• 自動(dòng)背景扣除功能，可有效剔除板材及封板膜自發(fā)熒光。

3. 定量范圍與線性度

• 定量檢測范圍：10^1–10^9 copies；

• 標(biāo)準(zhǔn)曲線線性回歸系數(shù)（R2）：≥ 0.995；

• 檢測限：可檢測到數(shù)拷貝水平的目標(biāo)序列。

五、軟件平臺(tái)與數(shù)據(jù)分析

1. 界面布局與功能模塊

• 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)向?qū)В豪孟驅(qū)浇缑嬷鸩皆O(shè)置擴(kuò)增程序、熒光通道與樣本布局；

• 實(shí)時(shí)監(jiān)控面板：實(shí)時(shí)展示每孔擴(kuò)增曲線及熔解曲線，支持多種縮放與對(duì)比分析；

• 模板管理：可儲(chǔ)存、導(dǎo)入、導(dǎo)出實(shí)驗(yàn)?zāi)０?，加快重?fù)實(shí)驗(yàn)設(shè)置。

2. 分析方法

• 定性分析：Ct（閾值循環(huán)數(shù)）判定、擴(kuò)增曲線形態(tài)學(xué)檢查；

• 相對(duì)定量：ΔΔCt 法，支持多種內(nèi)參基因設(shè)定；

• 絕對(duì)定量：利用標(biāo)準(zhǔn)品梯度曲線自動(dòng)計(jì)算樣本拷貝數(shù)；

• 熔解曲線分析：可對(duì) PCR 產(chǎn)物進(jìn)行熔解曲線圖譜比對(duì)，檢測特異性與引物二聚體；

• 多重分型：基于不同熒光通道同時(shí)分析 SNP 位點(diǎn)。

3. 報(bào)告與導(dǎo)出

• 數(shù)據(jù)輸出格式：CSV、Excel、PDF、圖像（JPEG、PNG）；

• 自定義報(bào)告模板：支持添加實(shí)驗(yàn)信息、曲線圖、統(tǒng)計(jì)表格與備注；

• 批量導(dǎo)出功能：可一次性導(dǎo)出多個(gè)實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

六、典型應(yīng)用場景

1. 基因表達(dá)研究

• 在細(xì)胞學(xué)、發(fā)育生物學(xué)及藥物篩選研究中，通過熒光標(biāo)記引物對(duì)目標(biāo)基因進(jìn)行精準(zhǔn)定量；

• 可同時(shí)對(duì)多種轉(zhuǎn)錄本進(jìn)行監(jiān)測，適合高通量篩選。

2. 病原體檢測

• 在公共衛(wèi)生和臨床診斷中，快速檢測病毒（如流感病毒、冠狀病毒）、細(xì)菌（如結(jié)核分枝桿菌）、真菌 DNA；

• 短循環(huán)時(shí)間可實(shí)現(xiàn) 40 min 內(nèi)的初步定性結(jié)果。

3. 轉(zhuǎn)基因作物與食品安全

• 檢測樣本中常見的轉(zhuǎn)基因片段（如 35S 啟動(dòng)子、NOS 終止子）；

• 在食品安全監(jiān)管中，對(duì)潛在過敏原和污染物進(jìn)行定量分析。

4. SNP 分型與拷貝數(shù)變異

• 使用熒光探針技術(shù)實(shí)現(xiàn)單堿基多態(tài)性位點(diǎn)的精確定性與分型；

• 拷貝數(shù)變異分析支持基因擴(kuò)增或缺失檢測。

5. 微生物群落定量

• 配合特定引物組，可針對(duì)環(huán)境樣本或腸道菌群進(jìn)行定量分析；

• 應(yīng)用于生態(tài)學(xué)、疾病模型研究等領(lǐng)域。

七、儀器日常操作與維護(hù)

1. 開機(jī)與關(guān)機(jī)流程

• 開機(jī)前檢查電源與通信線連接；

• 關(guān)機(jī)時(shí)先關(guān)閉軟件，再按順序斷開電源。

2. 試劑與耗材管理

• 建議選用低漂白或無漂白板材與封板膜，減少背景信號(hào)；

• 熒光探針、引物及酶體系應(yīng)儲(chǔ)存于 ?20 ℃，使用前室溫平衡。

3. 日常清潔

• 每次運(yùn)行結(jié)束后，用無塵布或?qū)I(yè)鏡頭紙輕拭光學(xué)窗口；

• 樣本架底板可定期用 70% 乙醇擦拭，防止樣本交叉污染。

4. 定期校準(zhǔn)

• 溫度校準(zhǔn)：至少每 6 個(gè)月進(jìn)行一次，可通過校準(zhǔn)板或標(biāo)準(zhǔn)試劑驗(yàn)證；

• 光學(xué)校準(zhǔn)：使用標(biāo)準(zhǔn)熒光染料或校準(zhǔn)板檢測各通道靈敏度。

5. 故障排查

• 軟件異常：重啟軟件或主機(jī)，檢查日志文件；

• 硬件報(bào)警：參考錯(cuò)誤代碼手冊(cè)，必要時(shí)聯(lián)系技術(shù)支持。

八、二手設(shè)備驗(yàn)收要點(diǎn)

1. 外觀檢查

• 機(jī)箱是否平整，無明顯劃痕或凹陷；

• 樣本架及蓋板運(yùn)動(dòng)是否順暢，無卡滯。

2. 功能驗(yàn)證

• 溫度響應(yīng)測試：運(yùn)行經(jīng)典梯度 PCR 程序，記錄升降溫速率與均一性；

• 熒光檢測測試：采用標(biāo)準(zhǔn)熒光板和陰性對(duì)照，檢測信號(hào)線性度與背景水平；

• 軟件操作：創(chuàng)建新實(shí)驗(yàn)、加載模板、執(zhí)行擴(kuò)增、生成并導(dǎo)出報(bào)告。

3. 配件完整性

• 樣本架、光學(xué)封板膜、電源線、通信線及軟件安裝盤或軟件授權(quán)文件是否齊全；

• 校準(zhǔn)報(bào)告、使用手冊(cè)及售后合同是否隨同交付。

九、典型使用案例

• 高校分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室
  某大學(xué)生命科學(xué)中心購入 LightCycler 96，用于腫瘤轉(zhuǎn)錄組差異表達(dá)研究，月均運(yùn)行 100 板次，結(jié)果重現(xiàn)性優(yōu)良；

• 第三方食品檢測機(jī)構(gòu)
  采用本儀器開展轉(zhuǎn)基因成分定量分析，支持 ISO17025 及 GMP 質(zhì)量管理體系審核；

• 區(qū)域疾病控制中心
  在流感季節(jié)，將其用于呼吸道病原體核酸檢測，實(shí)現(xiàn)日均 500 例樣本篩查。

十、售后服務(wù)與技術(shù)支持

1. 質(zhì)保條款

• 核心部件（溫控模塊、光學(xué)模塊）質(zhì)保期 6 個(gè)月；

• 其他易損件（封板膜、密封圈）質(zhì)保期 3 個(gè)月。

2. 技術(shù)培訓(xùn)

• 提供儀器安裝與使用培訓(xùn)，包含軟件操作與常見問題處理；

• 可根據(jù)需求安排上門培訓(xùn)。

3. 遠(yuǎn)程與現(xiàn)場支持

• 遠(yuǎn)程診斷：通過專用軟件監(jiān)控運(yùn)行狀態(tài)并分析日志；

• 現(xiàn)場服務(wù)：簽署服務(wù)協(xié)議后，在 48 小時(shí)內(nèi)派遣工程師（限國內(nèi)主要城市）。

4. 配件與升級(jí)

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5. 十二、配件及選購建議

6. 擴(kuò)展模塊

1. 梯度模塊：可選裝的梯度溫區(qū)附件，可實(shí)現(xiàn)不同溫度條件的平行擴(kuò)增，適合引物退火溫度篩選；

2. 多孔板適配器：支持 384 孔板和 72 條管格式，滿足超高通量需求。

7. 軟件選配

1. 數(shù)據(jù)管理系統(tǒng)（LIMS）接口：可將實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)自動(dòng)上傳至實(shí)驗(yàn)室信息管理系統(tǒng)；

2. 高級(jí)統(tǒng)計(jì)插件：包含聚類分析、主成分分析（PCA）等功能，用于大規(guī)模數(shù)據(jù)挖掘。

8. 耗材與試劑

1. 低漂白微孔板：推薦采用無漂白或低漂白板材，減少背景熒光；

2. 光學(xué)封板膜：優(yōu)選超低自發(fā)熒光專用膜，保證檢測靈敏度；

3. 熒光探針體系：羅氏探針試劑盒及多家兼容品牌試劑均可配合使用，用戶可根據(jù)預(yù)算和實(shí)驗(yàn)要求選擇。

9. 選購建議

1. 實(shí)驗(yàn)規(guī)模：常規(guī)實(shí)驗(yàn)室建議標(biāo)配 96 孔板，若短期內(nèi)有大量樣本，可考慮同時(shí)采購梯度與多孔板適配器；

2. 經(jīng)費(fèi)預(yù)算：二手設(shè)備與全新設(shè)備在初期投入上相差顯著，結(jié)合實(shí)驗(yàn)室總體預(yù)算與項(xiàng)目周期做綜合決策；

3. 售后服務(wù)：確認(rèn)供應(yīng)商提供的軟件授權(quán)、質(zhì)保期與工程師響應(yīng)時(shí)間；

10. 十三、進(jìn)階實(shí)驗(yàn)應(yīng)用

11. 數(shù)字 PCR（dPCR）預(yù)實(shí)驗(yàn)

1. 雖然 LightCycler 96 非數(shù)字 PCR 儀，但可用作高靈敏度預(yù)實(shí)驗(yàn)平臺(tái)，對(duì)樣本進(jìn)行初步擴(kuò)增與 Ct 值篩選，為后續(xù)數(shù)字 PCR 定量提供參考；

12. 多重 PCR 優(yōu)化

1. 通過調(diào)整熒光通道及引物濃度，實(shí)現(xiàn)對(duì) 3–4 個(gè)目標(biāo)序列的同時(shí)檢測；

2. 借助梯度模塊優(yōu)化不同引物對(duì)的退火溫度，減少非特異擴(kuò)增；

13. 甲基化特異 PCR

1. 配合甲基化敏感探針，進(jìn)行基因組 DNA 甲基化水平定量；

2. 可在常規(guī) qPCR 基礎(chǔ)上，通過設(shè)計(jì)特異性引物實(shí)現(xiàn)甲基化與未甲基化序列區(qū)分；

14. miRNA 表達(dá)譜分析

1. 利用干擾性引物和熒光探針體系，對(duì)短小 RNA 片段進(jìn)行擴(kuò)增與定量；

2. 需要在反轉(zhuǎn)錄環(huán)節(jié)加入特定的適配器序列；

15. 十四、常見問題與解決方案

16. 問題描述	可能原因	解決方案
    Ct 值波動(dòng)大，重復(fù)性差	樣本上機(jī)前溫度不均一；試劑配制不準(zhǔn)確；板材質(zhì)量低	樣本及試劑室溫平衡；使用多通道移液器；選用低漂白板與封板膜。
    擴(kuò)增曲線形狀異常（平緩或遲滯）	引物設(shè)計(jì)問題；模板純度不夠；熒光探針失效	重新設(shè)計(jì)引物并做梯度退火溫度預(yù)測；純化模板或稀釋檢測；更換熒光探針。
    熔解曲線出現(xiàn)多峰	非特異擴(kuò)增或引物二聚體	檢查熔解曲線溫度范圍；優(yōu)化引物濃度與退火溫度；在擴(kuò)增體系中加入 DMSO 或甘油。
    光學(xué)報(bào)警，無法讀取熒光信號(hào)	板材與膜貼合不嚴(yán)或位置偏移；光學(xué)窗口臟污	重新貼膜并校正樣本架位置；用無塵紙或鏡頭紙清潔光學(xué)窗口。
    軟件崩潰或報(bào)錯(cuò)	軟件版本與操作系統(tǒng)不兼容；用戶文件損壞	升級(jí)至最新授權(quán)版本；備份并重新導(dǎo)入實(shí)驗(yàn)?zāi)０?；?lián)系技術(shù)支持獲取安裝包及補(bǔ)丁。
    溫度不達(dá)標(biāo)或溫差超標(biāo)	溫控模塊老化；散熱風(fēng)扇故障	進(jìn)行溫控模塊校準(zhǔn)或更換；檢查風(fēng)扇及散熱通道是否被堵塞，必要時(shí)清理或更換風(fēng)扇。

17. 十五、技術(shù)參數(shù)匯總（附錄）

18. 參數(shù)類型	指標(biāo)
    孔板通量	96 孔/板，支持兼容 384 孔與條管格式
    溫度控制精度	±0.1 ℃
    溫度均勻性	≤ 0.3 ℃
    最大升溫速率	4.5 ℃/s
    最大降溫速率	3.5 ℃/s
    激發(fā)光源	RGBY 四色 LED
    檢測通道	最多 5 通道（可選）
    熒光染料兼容性	FAM, HEX/VIC, ROX, Cy5, Cy3 等
    靈敏度	單拷貝級(jí)別
    線性范圍	101–10? copies
    線性回歸系數(shù) (R2)	≥ 0.995
    觸摸屏尺寸	7 英寸
    軟件輸出格式	CSV, Excel, PDF, JPEG, PNG
    通訊接口	USB 2.0 ×2, LAN ×1
    電源要求	AC 100–240 V, 50/60 Hz
    工作環(huán)境溫度	15–30 ℃
    相對(duì)濕度	20–80%（無冷凝）
    關(guān)機(jī)功耗	＜ 5 W

19. 以上內(nèi)容涵蓋了 LightCycler 96 的設(shè)計(jì)結(jié)構(gòu)、性能指標(biāo)、檢測系統(tǒng)、軟件平臺(tái)、應(yīng)用領(lǐng)域、操作維護(hù)、配件選購、進(jìn)階應(yīng)用、常見問題及技術(shù)參數(shù)，幫助用戶全面了解該儀器的功能特點(diǎn)及使用要點(diǎn)。