羅氏LightCycler® PRO系統(tǒng)技術(shù)介紹

一、系統(tǒng)概述

LightCycler® PRO 系統(tǒng)是羅氏診斷公司基于多年實時熒光定量PCR（Real-Time Quantitative PCR, qPCR）技術(shù)研發(fā)經(jīng)驗推出的一款集性能穩(wěn)定、分析能力全面、流程智能化于一體的定量PCR平臺。該系統(tǒng)主要面向科研機(jī)構(gòu)、臨床實驗室、生物制藥企業(yè)等單位，用于基因表達(dá)定量、基因分型、拷貝數(shù)變異檢測、病原體篩查及個體化用藥研究等方向。

LightCycler® PRO 系統(tǒng)在設(shè)計上延續(xù)了羅氏LightCycler系列的熒光檢測技術(shù)與模塊化架構(gòu)，融合自動化樣本處理、高精度熱控技術(shù)及靈活的軟件控制平臺，支持多種樣本類型與反應(yīng)體系，具備中高通量檢測能力。

二、系統(tǒng)構(gòu)成與功能模塊

LightCycler® PRO 系統(tǒng)由以下幾個核心組成部分構(gòu)成：

1. 熱循環(huán)模塊（Thermal Cycler）

該模塊是實現(xiàn)PCR擴(kuò)增反應(yīng)的核心單元，配備先進(jìn)的半導(dǎo)體熱電技術(shù)，支持快速升降溫與溫控精度保障。

• 反應(yīng)孔數(shù)：標(biāo)準(zhǔn)96孔格式（兼容部分Fast孔板）

• 溫控范圍：4°C – 99°C

• 升降溫速率：最高可達(dá)4.8°C/s

• 溫控精度：±0.2°C

熱循環(huán)系統(tǒng)采用鋁合金均熱板與精準(zhǔn)探針監(jiān)測技術(shù)，提升反應(yīng)一致性與可重復(fù)性，適應(yīng)復(fù)雜基因體系的擴(kuò)增需求。

2. 熒光檢測系統(tǒng)（Optical Module）

LightCycler® PRO 系統(tǒng)配置多通道熒光信號檢測通道，基于高靈敏CCD或PMT組件，結(jié)合濾光片組可實現(xiàn)不同熒光染料的獨立通道檢測，支持SYBR Green、TaqMan、MGB、Scorpion、Molecular Beacon等多種熒光標(biāo)記方法。

• 熒光通道數(shù)：4–6個可選

• 檢測靈敏度：低至1拷貝/反應(yīng)（依試劑體系而定）

• 背景抑制：具備自動增益控制與背景校正算法

• 兼容染料示例：FAM, VIC, ROX, Cy5, HEX, Texas Red等

3. 軟件控制與分析平臺

LightCycler® PRO 搭配專屬軟件套件，支持實驗方案設(shè)計、數(shù)據(jù)實時監(jiān)控、圖譜生成與統(tǒng)計分析，具有圖形化操作界面和權(quán)限管理功能。

主要功能模塊包括：

• 擴(kuò)增曲線繪制與Ct值自動判讀

• 熔解曲線分析（Melting Curve Analysis）

• 標(biāo)準(zhǔn)曲線法定量與相對表達(dá)分析

• 基因分型（Genotyping）

• 拷貝數(shù)變異檢測（CNV）

• SNP分析與群體比較

• LIMS系統(tǒng)對接與批處理導(dǎo)出

數(shù)據(jù)可導(dǎo)出為CSV、Excel、PDF等格式，便于后期整合、共享或歸檔管理。

三、技術(shù)特性與性能指標(biāo)

1. 熱循環(huán)均勻性

LightCycler® PRO系統(tǒng)在熱循環(huán)控制方面采用雙溫探針實時反饋與PID調(diào)節(jié)機(jī)制，可有效控制孔間溫差與時間偏差?？装暹吘壟c中心位置的擴(kuò)增效率一致性表現(xiàn)良好。

• 孔間最大溫差：<0.4°C（測試條件下）

• 重復(fù)性Ct標(biāo)準(zhǔn)差：<0.15（相同模板條件下）

2. 擴(kuò)增動態(tài)范圍

系統(tǒng)具備廣泛的擴(kuò)增動態(tài)范圍，能夠檢測從1拷貝至10^9拷貝/反應(yīng)的DNA模板，適用于低豐度RNA檢測與高表達(dá)基因分析。

• 線性范圍：> 9 log數(shù)量級

• 檢測極限：<10 copies（結(jié)合配套試劑）

3. 多重PCR兼容性

支持最多6重目標(biāo)基因同時檢測，適用于病原譜篩查、多基因調(diào)控研究、miRNA表達(dá)定量等多重分析實驗。

• 熒光串?dāng)_修正算法：自動進(jìn)行信號解卷積與參考染料標(biāo)準(zhǔn)化處理

• 模板類型支持：gDNA、cDNA、RNA、質(zhì)粒、病毒DNA/RNA等

四、典型應(yīng)用場景

LightCycler® PRO系統(tǒng)可適用于多種實驗室應(yīng)用領(lǐng)域，涵蓋從基礎(chǔ)科研到臨床轉(zhuǎn)化的多個階段。

1. 基礎(chǔ)科研

• 基因表達(dá)水平差異分析（e.g., ΔΔCt法）

• miRNA定量檢測與功能分析

• 表觀遺傳學(xué)（甲基化狀態(tài)）檢測

• RNA干擾實驗驗證與小分子靶點篩選

2. 臨床研究與疾病標(biāo)志物評估

• 癌癥早期篩查（ctDNA、cfDNA定量）

• 傳染病病原體核酸檢測（如HIV, HPV, HBV等）

• 自身免疫病相關(guān)基因表達(dá)分析

• 精準(zhǔn)用藥（Pharmacogenomics）基因型檢測

3. 藥物開發(fā)與生物制品質(zhì)量控制

• 疫苗臨床前動物實驗中的病毒載量監(jiān)測

• 生物制劑殘留DNA含量檢測

• 穩(wěn)定性試驗中基因表達(dá)水平定點監(jiān)控

• 拷貝數(shù)一致性與批間變異控制

4. 公共衛(wèi)生與食品安全

• 食品中致病微生物快速篩查

• 轉(zhuǎn)基因成分定量分析

• 飲用水和農(nóng)產(chǎn)品中特定核酸污染檢測

五、配套耗材與試劑體系

為保障實驗流程一致性，羅氏提供完整的配套試劑和耗材體系：

• 反應(yīng)試劑盒：SYBR Green I Master, Probe Master, UPL系統(tǒng)等；

• PCR耗材：96孔/384孔反應(yīng)板、封板膜、反應(yīng)管、封口膜；

• 引物探針設(shè)計支持：UPL設(shè)計工具、參考數(shù)據(jù)庫；

• 標(biāo)準(zhǔn)模板與質(zhì)控品：便于構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線或Ct漂移監(jiān)控；

所有配套試劑均經(jīng)驗證可適用于LightCycler® PRO系統(tǒng)，避免因耗材變動引發(fā)的系統(tǒng)漂移或反應(yīng)效率不一致。

六、操作流程與培訓(xùn)機(jī)制

LightCycler® PRO系統(tǒng)采用模塊化工作流程，操作簡便，適合具有基礎(chǔ)分子實驗經(jīng)驗的操作人員使用。

操作流程簡要如下：

1. 樣本制備：提取DNA/RNA，必要時進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄；

2. 試劑準(zhǔn)備：配置Master Mix，加入模板與引物探針；

3. 反應(yīng)設(shè)置：裝載PCR板，設(shè)置程序參數(shù)；

4. 實時監(jiān)控：通過軟件查看擴(kuò)增進(jìn)度、Ct值與熔解曲線；

5. 結(jié)果分析：自動分析模塊完成定量計算與分型判讀；

6. 數(shù)據(jù)導(dǎo)出與存檔：保存至本地、服務(wù)器或LIMS系統(tǒng)。

羅氏同時提供技術(shù)培訓(xùn)服務(wù)，包括線上模塊教學(xué)、現(xiàn)場演示、使用手冊與遠(yuǎn)程協(xié)助，協(xié)助實驗人員快速掌握系統(tǒng)操作。

七、質(zhì)量控制與維護(hù)建議

為了確保長期使用中的穩(wěn)定性與性能一致性，建議實驗室按照以下原則對LightCycler® PRO系統(tǒng)進(jìn)行定期維護(hù)：

• 每日清潔：鏡頭窗口與熱蓋需保持潔凈；

• 每月校準(zhǔn)：熒光信號校準(zhǔn)與熱控模塊驗證；

• 年度維護(hù)：聯(lián)系技術(shù)工程師進(jìn)行整機(jī)檢查與軟件更新；

• 運行日志記錄：便于追蹤歷史參數(shù)變化與運行趨勢；

• 軟件權(quán)限管理：防止操作配置誤改與數(shù)據(jù)丟失；

系統(tǒng)內(nèi)置日志功能可自動記錄運行狀態(tài)、程序修改與使用者信息，有利于實驗室溯源管理和質(zhì)量審核。

八、結(jié)語

LightCycler® PRO 系統(tǒng)作為羅氏診斷在qPCR技術(shù)體系中的重要產(chǎn)品之一，集成了熱控、光學(xué)、軟件與數(shù)據(jù)管理等多方面功能，滿足了多樣化科研與臨床研究對數(shù)據(jù)質(zhì)量、流程效率與靈活應(yīng)用的需求。在持續(xù)發(fā)展的分子檢測技術(shù)環(huán)境下，系統(tǒng)化、標(biāo)準(zhǔn)化的qPCR平臺為生命科學(xué)研究提供了重要支持。